15歲時參加上海電視臺的綜藝舞蹈隊，正式自食其力自己賺取學費。
1993年，被選中主演電影《劉海粟》，那是她的第一次觸電經歷，收獲800元片酬。1994年，考入上海戲劇學院94級表演系本科。
1996年，與保劍峰、陳龍、高曙光、張雅琳共同出演了電視劇《真空愛情記錄》，講述了一群大學畢業(yè)生為了工作和愛情奮斗的故事。
1998年，畢業(yè)于上海戲劇學院，畢業(yè)后參演了第一部改編自陜西駐滬作家李春平同名小說的電影《玻璃是透明的》，馬伊琍飾演“小丫子”，同年出演的第一部古裝電影《孔乙己》至今沒有公映。
2000年，出演了《黑洞》飾演演三陪女，馬伊琍的表演事業(yè)得到了更好的提升，在電視劇《前世今生》中飾演美貌且氣質超凡的秦婉瑩。
2001年，出演電視劇《白天睡覺的女人》飾演李秀，在電影《西施眼》中飾演施雨，該劇在2002年美國夏威夷國際電影節(jié)中獲評審團大將及亞洲最佳電影。2002年，因出演電視劇《還珠格格Ⅲ之天上人間》中紫薇一角而被大眾所熟知。2004年，出演了由黃磊指導的《天一生水》飾演一個混血姑娘明妮。
2005年，出演張黎導演的電視劇《錦衣衛(wèi)》在劇中就出演了一個這樣的傾國美人客印月。
2006年，參演《喬家大院》扮演的“江雪瑛”，2007年，出演由趙寶剛指導的青春勵志電視劇《奮斗》而知名度得到進一步的提升。
2008年，因拍電視劇《為誰心動》時無悔剃光了頭，憑借影片《江北好人》，馬伊琍戰(zhàn)勝了李冰冰、范冰冰兩位大熱候選人，成為了長春電影節(jié)影后。
2009年，與佟大為共同出演了電視劇《婚姻保衛(wèi)戰(zhàn)》演出夫妻間事。同年馬伊琍出演了首部反映豫商故事的電視劇《經緯天地》在CCTV-8播出，這也是她繼《喬家大院》之后首次登陸央視，馬伊琍扮演尚達志的妻子順兒，這也是馬伊琍生產復出首部電視劇作品。
2010年，與涂松巖領銜主演的都市題材電視劇《雙城生活》反映了“雙城戀”話題，讓許多觀眾產生了不小共鳴并引發(fā)了網絡熱議，而馬伊琍在劇中飾演北京大妞郝京妮。憑借該劇獲得國劇盛典2011年度最佳女演員。
2013年，年初馬伊琍與杜淳、劉莉莉、陳思斯等眾多明星合作的電視劇《青春期撞上更年期Ⅱ》，此外，還客串電影《不二神探》，并且徹底顛覆以往的形象。
2013年，首當制片人的馬伊琍與首次當導演的丈夫文章合作的電視劇《小爸爸》。
